Akt1基因修饰的骨髓MSCs治疗ConA诱导的小鼠急性肝损伤的实验研究

【摘要】研究目的：1.原代培养出小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)并鉴定；2.构建PMSCV-Aktl-IRES-GFP逆转录病毒载体,感染MSCs,并筛选、扩增Akt过表达的MSCs;3.体外研究过表达Akt1对小鼠MSCs生物学功能的影响；4.观察Aktl-MSCs对不同浓度刀豆蛋白A(ConA)诱导的肝损伤模型的疗效。研究方法：取C57小鼠胫骨和股骨,利用MSCs的贴壁生长能力进行分离,并对获取的细胞进行流式鉴定和成软骨和成脂培养；构建Aktl-IRES-GFP逆转录病毒载体,感染MSCs,并筛选、扩增Aktl过表达的MSCs,并同时构建GFP-MSCs作为对照；使用RT-PCR及westernblot的方法检测Aktl-MSCs的Akt1的基因、蛋白及磷酸化蛋白的表达水平；分别用浓度为10ng/ml、50ng/ml、100ng/mlIFN-γ处理Aktl-MSCs及GFP-MSCs细胞,采用四唑氮化合物(MTS)法测定MSCs的生长情况并绘制生长曲线,通过Ca2+依赖性磷脂结合蛋白/碘化丙啶(AnnexinV/PI)复染,观察不同浓度IFN-γ对Aktl-MSCs及MSCs细胞凋亡的影响,并使用pcr-array对Aktl-MSCs及GFP-MSCs的凋亡信号通路进行检测,比较两者的异同；使用RT-PCR的方法检测10ng/mlIFN-γ刺激前后Aktl-MSCs及GFP-MSCs中Akt1、IL-4、IL-10、VEGF、HGF及PGE2的表达情况；使用ELISA的方法检测经浓度分别为10ng/ml、50ng/ml、100ng/mlIFN-γ刺激Aktl-MSCs及GFP-MSCs后,培养基中IL-4、IL-10、VEGF、HGF及PGE2的含量；使用Aktl-MSCs及GFP-MSCs治疗致死剂量ConA(40mg/kg)所致小鼠急性肝损伤,观察小鼠的生存情况并绘制生存曲线并了解小鼠肝脾的病理变化；使用Aktl-MSCs及GFP-MSCs治疗ConA(20mg/kg)所致的急性肝损伤模型,观察AST、ALT、TNF-α及IFN-γ的及肝脾病理变化,同时使用ELISA方法检测小鼠血清中IL-4、IL-10、VEGF、HGF及PGE2的含量并通过活体成像观察Aktl-MSCs及GFP-MSCs在ConA所致的急性肝损伤模型中向肝脏的归巢情况。研究结果：成功培养出小鼠MSCs:MSCs高表达CD29、CD44、Sca-1,而不表达造血细胞标志CD45、CD34,也不表达CD11b、CD31、FLK-1、MHC-Ⅱ类分子,成功将MSCs诱导分化成为软骨细胞和脂肪细胞;成功筛选并扩增出Akt1-MSCs,RT-PCR显示Aktl-MSCs的Aktl基因表达量明显高于GFP-MSCs(P<0.01),Westernblot显示Aktl-MSCs的总Aktl蛋白及磷酸化Akt(Ser473)蛋白均高于GFP-MSCs;细胞增殖及凋亡实验显示在正常培养及高浓度IFN-γ(100ng/ml)的刺激下,Aktl-MSCs显示出了增殖及抗凋亡优势,PCR-array显示Akt1-MSCs可显著抑制外源性凋亡通路；RT-PCR显示,Aktl-MSCs的Akt1、IL-4、IL-10、VEGF、HGF及PGE-2的基因表达水平均高于GFP-MSCs,在采用10ng/mlIFN-γ刺激后,Aktl-MSCs及GFP-MSCs的Akt1、IL-4、IL-10、HGF及PGE2的基因表达水平均有所上调,但Aktl-MSCs上调幅度更明显,且VEGF的基因表达水平未见明显上调；分别采用不同浓度(10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml)IFN-γ刺激Aktl-MSCs及GFP-MSCs后,ELISA结果显示：在10ng/ml、50ng/mlIFN-γ刺激12h后,Akt1-MSCs培养基中IL-10浓度明显高于GFP-MSCs,在100ng/mlIFN-γ刺激12h后,Aktl-MSCs及GFP-MSCs的细胞因子IL-10表达水平无明显差异。在10ng/ml、50ng/ml、100ng/mlIFN-γ刺激后,细胞因子PGE-2的含量两者无明显差异,而Aktl-MSCs培养基中HGF和VEGF的浓度显著高于GFP-MSCs。由于培养基IL-4浓度过低(各组均<4pg/ml),未得出可分性的数据；使用Akt1-MSCs及GFP-MSCs治疗致死剂量ConA(40mg/kg)所致的小鼠急性肝损伤,小鼠共分为5组,每组10只。24小时后,ConA40mg/kg、ConA40mg/kg+l×106Akt1-MSCs、ConA40mg/kg+1×106MSCs的三组小鼠均全部死亡,ConA40mg/kg+5×106Akt1-MSCs组存活3只、ConA40mg/kg+5×106MSCs组存活1只。使用Aktl-MSCs及GFP-MSCs治疗ConA(20mg/kg)所致的小鼠急性肝损伤模型,结果显示：与GFP-MSCs相比,Aktl-MSCs可以更好地降低小鼠血清中AST、ALT、TNF-α及IFN-γ水平和改善小鼠肝脏病理损伤情况,其中AST及IFN-γ的降低尤为显著。Akt1-MSCs治疗组小鼠血清中IL-10、VEGF、HGF及的浓度均高于GFP-MSCs治疗组小鼠,而由于小鼠血清中IL-4浓度过低(各组均<4pg/ml,故未得出可分性的数据)。活体成像结果显示,第0天,ConA+Aktl-MSCs组小鼠肝脏GFP荧光强度(465nm)强于ConA+GFP-MSCs组,单纯Aktl-MSCs及GFP-MSCs组未检测出明显荧光。第7天,ConA+Aktl-MSCs组小鼠肝脏GFP荧光强度(465nm)局部有所升高,而ConA+GFP-MSCs、Akt1-MSCs及GFP-MSCs组未检测出明显荧光。第14天,Aktl-MSCs组小鼠肝脏GFP荧光强度(465nm)强于MSCs组,而ConA+Akt1-MSCs和ConA+GFP-MSCs组未检测到明显荧光。研究结论：通过本研究,我们1)原代培养出小鼠MSCs,流式细胞免疫表型鉴定符合MSCs表型表达特点,并将MSCs诱导分化成为软骨细胞和脂肪细胞；2)构建PMSCV-Akt1-IRES-GFP逆转录病毒载体,感染MSCs,并筛选、扩增出出Akt1过表达的MSCs;3)Akt1-MSCs匕相同代数的MSCs在正常培养及高浓度IFN-γ(100ng/ml)的刺激下增殖及抗凋亡能力均明显优于GFP-MSCs;4)在lOng/mlIFN-γ刺激前后,Aktl-MSCs的部分细胞因子的基因表达水平高于GFP-MSCs,且Aktl-MSCs表现出对IFN-γ刺激更强的应激能力；5)在不同浓度(lOng/ml、50ng/ml、100ng/ml)IFN-γ刺激12h后,Aktl-MSCs的旁分泌功能优于GFP-MSCs;6)5×106Aktl-MSCs可提高致死剂量ConA(40mg/kg)所致的急性肝损伤小鼠的存活率；7)Akt1-MSCs可显著改善ConA(20mg/kg)所致的小鼠急性肝损伤状况；8)在ConA(20mg/kg)所致的小鼠急性肝损伤模型和正常小鼠中,Aktl-MSCs体现出了向肝脏归巢的优势。
【作者】周卢琨；
【导师】韩明哲；
【作者基本信息】北京协和医学院，血液内科学（专业学位），2014，博士
【关键词】Akt1；间充质干细胞；刀豆蛋白A；肝损伤；细胞治疗；

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